L'échantillon est irradié par une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 2,5 à 25 µm (soit 4000 à 400 cm-1). L'interaction photons/matière va se traduire par l'absorption de longueurs d'onde correspondant aux énergies de vibration de valence (ou élongation) et/ou de vibration de déformation angulaire des liaisons atomiques constituant les molécules du matériau.
La spectrométrie IR s'utilise principalement pour l'analyse qualitative d'une molécule. Elle permet de mettre en évidence la présence des principales fonctions chimiques.

Les principaux modes d'acquisition sont :
- en transmission : le faisceau lumineux traverse un film mince (solide ou liquide),
- en réflexion spéculaire : le faisceau frappe la surface de l'échantillon, les informations sont issues de la réflexion du faisceau diminué des longueurs d'onde absorbées par l'échantillon. Cette dernière méthode est particulièrement  adaptée au matériau trop absorbant ou épais ou présentant une difficulté de mise en forme (préparation d'un film), ainsi qu'à l'étude de revêtement de surface, de peinture. Le couplage du spectromètre à un microscope permet une exploitation en réflexion du rayonnement IR, la résolution latérale du microscope ouvre le champ d'analyse aux particules, fibres…